ΜΕΤΡΗΣΗ ΕΝΖΥΜΙΚΗΣ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ

Τι πρέπει να γνωρίζετε:

1. Κατανόηση της ενζυμικής ενεργότητας των ενζύμων (ΕΕ)/ορισμός.
2. Τι χρειάζεται να γνωρίζουμε για τον προσδιορισμό της ΕΕ;
3. Γιατί ο πιο πάνω προσδιορισμός γίνεται σε αρχικές συνθήκες κορεσμού όταν η συγκέντρωση υποστρώματος (S=substrate) είναι υψηλή;
4.Ορισμός του katal και της μονάδας, Unit. Πως διαφέρουν;
5. Με ποιές 2 μεθόδους προσδιορίζουμε την αρχική ταχύτητα; Πως διαφέρουν οι 2 μεθοδοι;
6. Τι είναι αντιστρεπτή και τί μη αντιστρεπτή αναστολή ενζύμων; Πως διαφέρουν; Πως τις διακρίνουμε;
7. Πόσων ειδώ αντιστρεπτές αναστολές έχουμε και πως διαφέρουν;
8. Ενώ η αναστολή της ουρεάσης με salergan αντιστρέφεται με προσθήκη κυστεϊνης, αυτή της χολινεστεράσης με αλκυλοφωσφωρικό δεν αντιστρέφεται. Αιτιολογείστε την απάντησή σας.
9. Γιατί ο προσδιορισμός της χολινεστεράσης έχει διαγνωστική αξία;

Ενζυμική Κινητική κατά Michaelis-Menten

Ο πιο πάνω σύνδεσμος περιέχει εκτεταμένες σημειώσεις για τα ένζυμα. Για λεπτομέρειες περί της ενζυμικής κινητικής κατά ΜΜ δείτε μόνο τις σελίδες 24-40. Τα υπόλοιπα είναι προαιρετικά αν και θα σας έιναι χρήσιμα γενικά μιας και δεν έχετε διδαχθεί Βιοχημεία.
Επίσης, συμβουλευτείτε τα βιβλία των Stryer ή Lehninger ή του κ. Τρακατέλλη.

Εικόνα 1: Ταχύτητα ενζυμικής αντιδράσεως
 






Εικόνα 2: Κινητική Κορεσμού





Εικόνα 3: Εξίσωση Michaelis-Menten



Εικόνα 4: Σημασία του Km



Εικόνα 5: Σημασία του Vmax



Εικόνα 6: Παράδειγμα


Άσκηση

Ποιά η φυσιολογική και φυσική σημασία των Κm και Vmax;

1. Το Km  εκφράζει κατά προσέγγιση τα ενδοκυτταρικά επίπεδα συγκέντρωσης του υποστρώµατος (Οράτε την εικόνα 6).

2. Το Km  είναι σταθερό και χαρακτηριστικό για κάθε ένζυµο και το υπόστρωµά του κάτω από δεδοµένες πειραµατικές συνθήκες pH, θερµοκρασίας, πίεσης κλπ. 

3. Το Km  µπορεί να χρησιµοποιηθεί για να συγκρίνουµε ένζυµα είτε από διαφορετικούς οργανισµούς, είτε από διαφορετικούς ιστούς του ίδιου οργανισµού.

4. Μετρώντας το Km  µιας ενζυµικής αντίδρασης, µπορούµε να ρυθµίσουµε τη συγκέντρωση του S να είναι κατά πολύ µεγαλύτερη της τιµής του Km  µε σκοπό να προσδιορίσουµε το Vmax και περαιτέρω τη συγκέντρωση του ενζύµου E, που αντιπροσωπεύει τη συγκέντρωση του συνολικού ενζύµου.
Η προσέγιση αυτή µπορεί να χρησιµοποιηθεί για τον “σχετικά ακριβή ποσοτικό προσδιορισµό” ενός ενζύµου (της ενζυμικής του ενεργότητας, ΕΕ) σε βιολογικά παρασκευάσµατα χωρίς να είναι αναγκαίος ο καθαρισµός του. Ό,τι πράξαμε στο πείραμα.

5. Μελετώντας την επίδραση διαφόρων παραγόντων στη τιµή του Km µπορούµε να αντιληφθούμε τον τρόπο δράσης και την επίδραση αυτών των παραγόντων στο ένζυµο, όπως αναστολή, ενεργοποίηση κλπ.

6. Τέλος το Km  είναι ενδεικτικό για τη σχετική καταλληλότητα ενός ή περισσοτέρων υποστρωµάτων για ένα ένζυµο. Το καλύτερο υπόστρωµα για ένα ένζυµο είναι εκείνο µε τη µεγίστη τιµή στη σχέση Vmax / Km

ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ-ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ

Στόχοι Μαθήματος

1. Γνώση των διαφορών των φασμάτων υπεριώδους, υπερύθρου και ορατού.
2. Κατανόηση του μεγίστου μήκους κύματος απορρόφησης μιας ουσίας, λmax
3. Διατύπωση και κατανόηση των συνεπειών του νόμου των Bouget-Lambert-Beer (BLB).
4. Γνώση και σχέση μεταξύ απορροφητικότητας (Α) ή οπτικής πυκνότητας (OD) και διαπερατότητας (Τ).
5. Τι εκφράζει ο συντελεστής μοριακής απορροφητικότητας, Εm, ποιές είναι οι μονάδες μέτρησης και ποιά είναι η σημασία του στη φασματοσκοπία.
6. Αποκλείσεις από τον νόμο των BLB
7. Τι είναι η καμπύλη φάσματος απορρόφησης και πως μετράται.
8. Τι είναι και πως κατασκευάζεται η πρότυπη καμπύλη απορρόφησης.
9. Κατανόηση της γενικής λειτουργίας του φωτόμετρου.
10. Πως μετράται η συγκέντρωση άγνωστης ουσίας με βάση την πρότυπη καμπύλη της.


Στοιχειώδης εισαγωγή 5 σελιδων στις αρχές της φασματοσκοπίας
http://web.mit.edu/5.33/www/lec/spec1.pdf

http://linus.chem.ku.edu/genchemlab/1902015/Introduction%20to%20Spectroscopy%20Chemistry%20185%20Fall%202012.pdf


ΥΠΟΔΕΙΓΜΑΤΙΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΑ

1. Να υπολογιστεί η απορροφητικότητα, Α, διαλύματος της πρωτεϊνης κυτοχρώματος C. Δίνονται: l=1 cm, c=0,5 mg/ml, Em=153000 1/M 1/cm και MB=13370 g/mol. 

2. Διαλυμα καθαρής αλβουμίνης χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή πρότυπης καμπύλης (με την μέθοδο προσδιορισμού της συγκέντρωσης πρωτεϊνών κατά Lowry) και έδωσε τα πιο κάτω αποτελέσματα.

BSA (Αλβουμίνη), μg/μl         0        20             40           60          80           100
A                                             0        0,05          0,10         0,15      0,20         0,23

Κατασκευάστε την πρότυπη καμπύλη.

α) Ποιά συγέντρωση έδωσε Α=0.12
β) Ποιά είναι η συγκέντρωση του διαλύματος όταν Α=0,25


ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗΣ

 1. Δώστε τους οριμμούς της απορροφητικότητας (Α), του φάσματος Α, της μοριακής απορροφητικότητας Εm και της διαπερτότητας.

2. Εξηγείστε γιατί η απορροφητικότητα είναι αδιάστατο μέγεθος.

3. Ποιές είναι οι διαστάσεις της Em ;

4. Σε ποιό νόμο στηρίζεται η φασματομετρία ;

ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΚΡΙΣΕΩΣ

1. Παρ' όλο που η απορροφούμενη ηλεκτρομαγνητική ενέργεια των φωτονίων (hv) είναι κβαντισμένη, τα φάσματα απορρόφησης είναι συνεχή. Να εξηγήσετε γιατί.

2. Ο συντελεστής Em εκφραζεται σε L/mol/cm. Από τί εξαρτώννται οι μονάδες του Em ;

3. Ποιά είναι η Α διαλύματος ουσίας όταν l=1 cm και Em=3782 L/mol/cm ;

4. Πως η Em μιας ουσίας επηρεάζει τη ευαισθησία του φασματοφωτομέτρου ;

5. Έχετε δυο ουσίες με Em ίσο με 10000 και 20 αντίστοιχα: Ποιά είναι πιο έυκολο να ανιχνευτεί αι γιατί ;

5. Ποιά η σημασία της Em στην φασματομετρία ;

ΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΑΙΜΑΤΟΣ

Τι πρέπει να γνωρίζετε:

1. Σύσταση και δομή λιποπρωτεϊνών. Με ποιές 2 μεθόδους ταξινομήθηκαν;

2. Πως διαφέρουν οι HDL, LDL, VLDL IDL (πίνακας 1, σελ. 83) ;

3. Ποιοί είναι οι κύριοι παράγοντες κινδύνου αθηροσκλήρυνσης και καρδιαγγειακών νοσημάτων (σελ. 82);

4. Κατανόηση των πινάκων Ι (σελ. 83) και ΙΙ (σελ. 85).

5. Ποιοί είναι οι κύριοι τύποι λιπρωτεϊνικών φαινοτύπων και πως διαφέρουν;

 

Οι πιο κάτω αναφορές περιέχουν περισσότερες λεπτομέρειες, ιδιαίτερα στον μεταβολισμό των λιποπρωτεϊνών για όσους ενδιαφέρονται περαιτέρω.

1) Λιποπρωτεϊνες και Αθηροσκλήρυνση (Ελληνιστί)

2) Σύσταση, δομή και μεταβολισμός λιποπρωτεϊνών (Αγγλιστί)


Επίσης, 2 βιντεο επισκόπησης στο youtube:

1) Μεταβολισμός Λιποπρωτεϊνών 

2) Νέες έννοιες στην αθηροσκλήρυνση