ΜΕΤΡΗΣΗ ΕΝΖΥΜΙΚΗΣ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ

Σκοποί της άσκησης:

1. Κατανόηση της έννοιας της ενζυμικής ενεργότητας των ενζύμων (ΕΕ)/ορισμός.
2. Τι χρειάζεται να γνωρίζουμε για τον προσδιορισμό της ΕΕ.
3. Γιατί ο πιο πάνω προσδιορισμός γίνεται σε αρχικές συνθήκες κορεσμού όταν η συγκέντρωση υποστρώματος (S=substrate) είναι υψηλή;
4.Ορισμός του katal και της μονάδας, Unit. Πως διαφέρουν;
5. Με ποιές 2 μεθόδους προσδιορίζουμε την αρχική ταχύτητα; Πως διαφέρουν οι 2 μεθοδοι;
6. Τι είναι αντιστρεπτή και τί μη αντιστρεπτή αναστολή ενζύμων; Πως διαφέρουν; Πως τις διακρίνουμε;
7. Πόσων ειδώ αντιστρεπτές αναστολές έχουμε και πως διαφέρουν;
8. Ενώ η αναστολή της ουρεάσης με salyrgan αντιστρέφεται με προσθήκη κυστεΐνης, αυτή της χολινεστεράσης με αλκυλοφωσφωρικό δεν αντιστρέφεται. Αιτιολογείστε την απάντησή σας.
9. Γιατί ο προσδιορισμός της χολινεστεράσης έχει διαγνωστική αξία;

Πειραματικό μέρος

Θα εκτελέσουμε 2 πειράματα χρησιμοποιώντας 2 ένζυμα, την ουράση και την ψευδοχολινεστεράση.

1) 1ο πείραμα: Υπολογισμός της ενεργότητας της ουρεάσης-Αντιστρεπτή αναστολή

-Ποιά αντίδραση καταλύει η ουρεάση; 
-Γιατί χρησιμοποιούμε τον δείκτη φαινολοφθαλεΐνη;
-Ποιός ο ρόλος του salyrgan;


2) 2ο πείραμα: Υπολογισμός ενεργότητας της ψευδοχολινεστεράσης-Μη αντιστρεπτή αναστολή

-Ποιά αντίδραση καταλύει η ψευδοχολινεστεράση;
-Ποιός ο ρόλος του αλκυλοφωσφορικού; 
-Πως διαφέρει από το salyrgan;

Ενζυμική κινητική κατά Henri-Michaelis-Menten 

Ο πιο πάνω σύνδεσμος περιέχει εκτεταμένες σημειώσεις για τα ένζυμα και προτείνεται ως υπόβαθρο για την κατανόηση της άσκησης. Για λεπτομέρειες περί της ενζυμικής κινητικής κατά ΜΜ δείτε μόνο τις σελίδες 222-227. 

Επίσης, συμβουλευτείτε τα βιβλία των Stryer ή Lehninger ή του κ. Τρακατέλλη.


Αντίδραση κατά Henri-Michaelis-Menten








Ερωτήσεις Συνόψισης

Ποιά η φυσιολογική και φυσική σημασία των Κm και Vmax;

1. Το Km  εκφράζει κατά προσέγγιση τα ενδοκυτταρικά επίπεδα συγκέντρωσης του υποστρώµατος (Οράτε την εικόνα 6).

2. Το Km  είναι σταθερό και χαρακτηριστικό για κάθε ένζυµο και το υπόστρωµά του κάτω από δεδοµένες πειραµατικές συνθήκες pH, θερµοκρασίας, πίεσης κλπ. 

3. Το Km  µπορεί να χρησιµοποιηθεί για να συγκρίνουµε ένζυµα είτε από διαφορετικούς οργανισµούς, είτε από διαφορετικούς ιστούς του ίδιου οργανισµού.

4. Μετρώντας το Km  µιας ενζυµικής αντίδρασης, µπορούµε να ρυθµίσουµε τη συγκέντρωση του S να είναι κατά πολύ µεγαλύτερη της τιµής του Km  µε σκοπό να προσδιορίσουµε το Vmax και περαιτέρω τη συγκέντρωση του ενζύµου E, που αντιπροσωπεύει τη συγκέντρωση του συνολικού ενζύµου.
Η προσέγιση αυτή µπορεί να χρησιµοποιηθεί για τον “σχετικά ακριβή ποσοτικό προσδιορισµό” ενός ενζύµου (της ενζυμικής του ενεργότητας, ΕΕ) σε βιολογικά παρασκευάσµατα χωρίς να είναι αναγκαίος ο καθαρισµός του. Ό,τι πράξαμε στο πείραμα.

5. Μελετώντας την επίδραση διαφόρων παραγόντων στη τιµή του Km µπορούµε να αντιληφθούμε τον τρόπο δράσης και την επίδραση αυτών των παραγόντων στο ένζυµο, όπως αναστολή, ενεργοποίηση κλπ.

6. Τέλος το Km  είναι ενδεικτικό για τη σχετική καταλληλότητα ενός ή περισσοτέρων υποστρωµάτων για ένα ένζυµο.

ΟΔΗΓΙΕΣ ΤΕΤΡΑΔΙΟΥ & ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΩΝ ΑΝΑΦΟΡΏΝ

  ΟΔΗΓΙΕΣ

Εργαστήρια Βιοχημείας, Ανοιξιάτικο Εξάμηνο 2017

 Ν. Αρ. Παπανικολάου

Τετράδιο

Μικρό τετράδιο με αριθμημένες σελίδες 

Στο εσωτερικό μέρος του εξωφύλλου επικολλήστε: 

1)  Μικρή φωτογραφία με την σφραγίδα του εργαστηρίου (από την  Γραμματέα  της Βιοχημείας, κ. Βακουφτσή).

 2) Ονοματεπώνυμο και ΑΕΜ

 3) Τον αριθμό Τμήματος (Α7 και Α14)

 4) Στην ετικέτα γράψτε το ονοματεπώνυμό σας και το τμήμα (Α7 ή Α14)

Δομή γραπτής αναφοράς πειραμάτων 

Α) Προετοιμάστε πριν έρθετε στο εργαστήριο:

 Εισαγωγή

(α) Σκοπός, 1-2 γραμμές

(β) Θεωρία, 4-5 γραμμές

Πειραματικό Μέρος

(α) Πίνακας ή κατάλογος υλικών και αντιδραστηρίων

(β) Πίνακας ή κατάλογος εξοπλισμού

(γ) Διάγραμμα ροής πειράματος (όπου είναι εφικτό)

(δ) Περιγραφή μεθόδου (ή μεθόδων) ανά πείραμα

Β) Κατά την διάρκεια της άσκησης:

Δεδομένα και Υπολογισμοί 

(α) Καταγραφή ακατέργαστων δεδομένων

(β) Μεθοδοι υπολογισμού με στατιστική ανάλυση

(γ) Οργάνωση/παρουσίαση τελικών δεδομένων σε πίνακες, γραφικά ή σε σχήματα

Αποτελέσματα και Ανάλυση 

(α) Συμπεράσματα, 4-5 σειρές

(β) Σύγκριση αποτελεσμάτων με (ει δυνατόν) γνωστές τιμές

(γ) Ανάλυση της σπουδαιότητας των δεδομένων, 4-5 σειρές

(δ) Έχει επιτευχθεί ο αρχικά διατυπωμένος σκοπός του πειράματος; Αν όχι, γιατί; Αιτιολόγηση

(ε) Άλλες εργασίες στην βιβλιογραφία

ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ

ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ

Στόχοι εργαστηρίου

1. Γνώση των διαφορών των φασμάτων υπεριώδους, υπερύθρου και ορατού.
2. Κατανόηση του μεγίστου μήκους κύματος απορρόφησης μιας ουσίας, λmax
3. Διατύπωση και κατανόηση των συνεπειών του νόμου των Bouget-Lambert-Beer (BLB).
4. Γνώση και σχέση μεταξύ απορροφητικότητας (Α) ή οπτικής πυκνότητας (OD) και διαπερατότητας (Τ).

5. Τι εκφράζει ο συντελεστής μοριακής απορροφητικότητας, Εm, ποιές είναι οι μονάδες μέτρησης και ποιά είναι η σημασία του στη φασματοσκοπία. Ένας άλλος, πιο χρηστικός ορισμός του Em: Είναι η απορροφητικότητα ενώσεως ανά μονάδα συγκεντρώσεως, C, και ανά μονάδα διανυθέντος μήκους της μονοχρωματικής ακτίνας (που δεν μεταβάλλεται) μέσω διαλύματος της ενώσεως. 

Συνέπεια: Όσο μεγαλύτερος είναι ο Em ενώσεως τόσο πιο πολύ απορροφά/μονάδα C και επομένως τόσο λιγότερη συγκέντρωση  χρειαζόμαστε για να την ανιχνεύσουμε.

 6. Πως υπολογίζεται ο Em. Πείραμα 1ο.
7. Πως υπολογίζεται η c αγνώστου δείγματος.
Με 2 μεθόδους, α) Απόλυτη μέθοδος: Πρέπει να είναι γνωστές οι: Em και Α, από τον νόμο BLB. β) Συγκριτική μέθοδος: Πρότυπο διάλυμα γνωστών συγκεντρώσεων δίνει Αγ όπως και το άγνωστο διάλυμα Αα.
8. Αποκλείσεις από τον νόμο των BLB
9. Τι είναι η καμπύλη φάσματος απορρόφησης φασματος, και λmax, και πως μετράται. Πείραμα 1ο.
10. Τι είναι και πως κατασκευάζεται η πρότυπη καμπύλη απορρόφησης.
11. Κατανόηση των μερών και της λειτουργίας του φωτόμετρου.
12. Πως μετράται η συγκέντρωση άγνωστης ουσίας με βάση την πρότυπη καμπύλη της από γνωστές συγκεντρώσεις. Πείραμα 2ο.

Η ενέργεια ακτινοβολίας δίνεται από την εξίσωση: Ε=hv=hc/λ

Προαπαιτούμενες γνώσεις για το εργαστηριακό μέρος

1) Πως παρασκευάζουμε διαλύμματα
2) Πως αραιώνουμε διαλύμματα
3) Τι είναι προσιφώνιο, σιφώνιο, μικροσιφώνιο.


Στοιχειώδης εισαγωγή 5 σελιδων στις αρχές της φασματοσκοπίας
Αρχές φασματοσκοπίας


ΥΠΟΔΕΙΓΜΑΤΙΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΑ

1. Να υπολογιστεί η απορροφητικότητα, Α, διαλύματος της πρωτεϊνης κυτοχρώματος C. Δίνονται: l=1 cm, c=0,5 mg/ml, Em=153000 1/M 1/cm και MB=13370 g/mol. 

2. Διαλυμα καθαρής αλβουμίνης χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή πρότυπης καμπύλης (με την μέθοδο προσδιορισμού της συγκέντρωσης πρωτεϊνών κατά Lowry) και έδωσε τα πιο κάτω αποτελέσματα.

BSA (Αλβουμίνη), μg/μl         0        20             40           60          80           100
A                                             0        0,05          0,10         0,15      0,20         0,23

Κατασκευάστε την πρότυπη καμπύλη.

α) Ποιά συγέντρωση έδωσε Α=0.12
β) Ποιά είναι η συγκέντρωση του διαλύματος όταν Α=0,25


ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗΣ

 1. Δώστε τους ορισμούς της απορροφητικότητας (Α), του φάσματος Α, της μοριακής απορροφητικότητας Εm και της διαπερατότητας.

2. Διατυπώστε τον νόμο των Bouget-Lambert-Beer και εξηγείστε με την εξίσωση των BLB γιατί η απορροφητικότητα είναι αδιάστατο μέγεθος.

3. Ποιές είναι οι διαστάσεις της Em ;

4. Σε ποιό νόμο στηρίζεται η φασματομετρία ;

5. Γιατί χρησιμοποιούμε τυφλό στις μετρήσεις της Α ;

ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΓΙΑ ΠΕΡΑΙΤΕΡΩ ΜΕΛΕΤΗ

1. Παρ' όλο που η απορροφούμενη ηλεκτρομαγνητική ενέργεια των φωτονίων (hv) είναι κβαντισμένη, τα φάσματα απορρόφησης είναι συνεχή. Να εξηγήσετε γιατί. 

2. Ο συντελεστής Em εκφραζεται σε L/mol/cm. Από τί εξαρτώννται οι μονάδες του Em ;

3. Ποιά είναι η Α διαλύματος ουσίας όταν l=1 cm και Em=3782 L/mol/cm ;

4. Πως η Em μιας ουσίας επηρεάζει τη ευαισθησία του φασματοφωτομέτρου ;

5. Έχετε δυο ουσίες με Em ίσο με 10000 και 20 αντίστοιχα: Ποιά είναι πιο έυκολο να ανιχνευτεί αι γιατί ;

5. Ποιά η σημασία της Em στην φασματομετρία ;