ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ -1

Εργαστήριο 1ο: Υδατικά Διαλύματα-pH -Αντικείμενα μάθησης

Α) Θεωρία, βιβλίο ασκήσεων, σελ. 1-5

Αμφίδρομες χημικές αντιδράσεις, σταθερά ισορροπίας Κi (Κa για οξέα)
Ορισμός ρυθμιστικών διαλυμάτων (ΡΔ) και χρήση
Αραίωση διαλυμάτων
Μοριακότητα, κανονικότητα, % κατ' όγκον σύσταση διαλυμάτων 
pH, ορισμός και μέτρηση
Παραδείγματα παρασκευής ΡΔ
Δείκτες

Β) Άσκηση, βιβλίο ασκήσεων, σελ. 6-10

Άσκηση 1η: Προσδιορισμός του pH αγνώστου διαλύματος με χρωματομετρία και pH-μετρο

Άσκηση 2η: Παρασκευή ΡΔ οξικού οξέως/οξικού νατρίου, 0.1 Μ και pH=5,0

Άσκηση 3η: Ρυθμιστική δράση του διαλύματος της 2ης άσκησης με τιτλοδότηση

ΟΔΗΓΙΕΣ ΓΙΑ ΤΑ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑ ΤΟΥ ΜΑΘΗΜΑΤΟΣ "ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΗΝ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ"-ΦΘΙΝΟΠΩΡΙΝΟ ΕΞΑΜΗΝΟ 2016

Τμήματα Α7, Α14 

  ΟΔΗΓΙΕΣ

Εισαγωγή στην Βιοχημεία, Φθινοπωρινό Εξάμηνο 2016

 Ν. Αρ. Παπανικολάου

Τετράδιο

Μικρό τετράδιο με αριθμημένες σελίδες 

Στο εσωτερικό μέρος του εξωφύλλου επικολλήστε: 

1)  Μικρή φωτογραφία με την σφραγίδα του εργαστηρίου (από την  Γραμματέα  της Βιοχημείας, κ. Βακουφτσή).

 2) Ονοματεπώνυμο και ΑΕΜ

 3) Τον αριθμό Τμήματος (Α7 και Α14)

 4) Στην ετικέτα γράψτε το ονοματεπώνυμό σας και το τμήμα (Α7 ή Α14)

Δομή γραπτής αναφοράς πειραμάτων (1) 

Α) Προετοιμάστε πριν έρθετε στο εργαστήριο:

 

 Εισαγωγή

(α) Σκοπός

(β) Θεωρία (σύντομη)

Πειραματικό Μέρος

(α) Πίνακας ή κατάλογος υλικών και αντιδραστηρίων

(β) Πίνακας ή κατάλογος εξοπλισμού

(γ) Διάγραμμα ροής πειράματος (όπου είναι εφικτό)

(δ) Περιγραφή μεθόδου (ή μεθόδων)

Β) Κατά την διάρκεια της άσκησης:

Δεδομένα και Υπολογισμοί

(α) Καταγραφή ακατέργαστων δεδομένων

(β) Μεθοδοι υπολογισμού με στατιστική ανάλυση

(γ) Οργάνωση/παρουσίαση τελικών δεδομένων σε πίνακες, γραφικά ή σε σχήματα

Αποτελέσματα και Ανάλυση

(α) Συμπεράσματα

(β) Σύγκριση αποτελεσμάτων με (ει δυνατόν) γνωστές τιμές

(γ) Ανάλυση της σπουδαιότητας των δεδομένων

(δ) Έχει επιτευχθεί ο αρχικά διατυπωμένος σκοπός του πειράματος; Αν όχι, γιατί; Αιτιολόγηση

(ε) Άλλες εργασίες στην βιβλιογραφία

ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ -2

Προσθήκη λεζάντας

ΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΑΙΜΑΤΟΣ

Τι πρέπει να γνωρίζετε:

1. Σύσταση και δομή λιποπρωτεϊνών. Με ποιές 2 μεθόδους ταξινομήθηκαν;

2. Πως διαφέρουν οι HDL, LDL, VLDL IDL (πίνακας 1, σελ. 83) ;

3. Ποιοί είναι οι κύριοι παράγοντες κινδύνου αθηροσκλήρυνσης και καρδιαγγειακών νοσημάτων (σελ. 82);

4. Κατανόηση των πινάκων Ι (σελ. 83) και ΙΙ (σελ. 85).

5. Ποιοί είναι οι κύριοι τύποι λιπρωτεϊνικών φαινοτύπων και πως διαφέρουν;

  H πιο κάτω ανασκόπηση περιέχει λεπτομέρειες, ιδιαίτερα στον μεταβολισμό των λιποπρωτεϊνών για όσους ενδιαφέρονται περαιτέρω.

Λιποπρωτεϊνες και Αθηροσκλήρυνση

Γενική δομή λιποπρωτεϊνικών σωματιδίων (ΛΠ)

 

Όλες οι ΛΠ περιέχουν:
1) Χοληστερόλη
2) Τριγλυκερίδια 

Οι ΛΠ διαφέρουν ως προς τα:
1) Μέγεθος
2) Ποσότητα χοληστερόλης
3) Ποσότητα τριγλυκεριδίων
4) Σύσταση πρωτεϊνών


Επίσης, 2 βιντεο επισκόπησης στο youtube:

1) Μεταβολισμός Λιποπρωτεϊνών 

2) Νέες έννοιες στην αθηροσκλήρυνση 

ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΓΛΥΚΟΖΗΣ / ΚΕΤΟΝΟΣΩΜΑΤΩΝ

Τι πρέπει να γνωρίζετε:

1. Σακχαρώδης Διαβήτης: Διάγνωση και ταξινόμηση

2. Δοκιμασία ανοχής της γλυκόζης

1) Άρθρο για τον σακχαρώδη διαβήτη

http://www.ngda.gr/innet/UsersFiles/ngda/documents/Xronika/2010_1o/02_Katsiki.pdf

2) Μέθοδοι προσδιορισμού της γλυκόζης:

https://uqu.edu.sa/files2/tiny_mce/plugins/filemanager/files/4250119/lectures/7._carbohydrates_cb2.pdf

3) Ανίχνευση υδατανθράκων με αντιδραστήρια Fehling & Benedict

http://ekfe-nikaias.att.sch.gr/portal/files_pdf/anixneysi_ydatanthrakon_Fehling_Benedict.pdf

4) Για όσους ενδιαφέρονται για την χημεία των υδατανθράκων.

https://repository.kallipos.gr/bitstream/11419/4693/1/%CE%9A%CE%95%CE%A6_5_%CE%93%CE%95%CE%9D%CE%99%CE%9A%CE%95%CE%A3%20%CE%99%CE%94%CE%99%CE%9F%CE%A4%CE%97%CE%A4%CE%95%CE%A3%20%CE%A4%CE%A9%CE%9D%20%CE%A5%CE%94%CE%91%CE%A4%CE%91%CE%9D%CE%98%CE%A1%CE%91%CE%9A%CE%A9%CE%9D.pdf

Ορισμός

Ο σακχαρώδης διαβήτης είναι χρόνια νόσος που χαρακτηρίζεται από υπεργλυκαιμία, διαταραχή του μεταβολισμού των υδατανθράκων, των λιπών και των πρωτεϊνών και οφείλεται σε μειονεκτική έκκριση ή σε μειονεκτική δράση της ινσουλίνης ή σε συνδυασμό των δύο.

Ταξινόμηση

Υπάρχουν 4 τύποι σακχαρώδους διαβήτη:

Σακχαρώδης διαβήτης τύπου 1 (ΣΔτ1): χαρακτηρίζεται από απόλυτη έλλειψη ινσουλίνης. Παλιότερα ονομάζονταν νεανικός σακχαρώδης διαβήτης και ινσουλινοεξαρτώμενος σακχαρώδης διαβήτης.

Σακχαρώδης διαβήτης τύπου 2 (ΣΔτ2)

Είναι ο συχνότερος τύπος καιχαρακτηρίζεται από τη συνύπαρξη διαταραχής της έκκρισης και της δράσης τηςινσουλίνης. Παλιότερα ονομάζονταν σακχαρώδης διαβήτης των ενηλίκων και μη ινσουλινοεξαρτώμενος σακχαρώδης διαβήτης.

Άλλοι τύποι σακχαρώδους διαβήτη

Οφείλονται σε γενετικές διαταραχές των β-κυττάρων, νοσήματα της εξωκρινούς μοίρας του παγκρέατος, φάρμακα, κλπ. 

Σακχαρώδης διαβήτης της κύησης

Ορίζεται ως διαταραχή του μεταβολισμού των υδατανθράκων ποικίλης βαρύτητας με έναρξη ή πρώτη αναγνώριση στην παρούσα εγκυμοσύνη.

Διαγνωστικά κριτήρια σακχαρώδους διαβήτη

Η διάγνωση του σακχαρώδους διαβήτη τίθεται όταν:

Γλυκόζη νηστείας πλάσματος ≥ 126  mg/dlμετά από νηστεία 8 ωρών

ή

Συμπτώματα υπεργλυκαιμίας και τυχαία τιμή γλυκόζης πλάσματος ≥ 200 mg/dl

Ο πιο κάτω σύνδεσμος περιέχει άρθρο για την αποτίμηση της καμπύλης ανοχής της γλυκόζης.

Assessing the Shape of the Glucose Curve During an Oral Glucose Tolerance Test

 

Τυχαία τιμή γλυκόζης θεωρείται οποιαδήποτε στιγμή του 24-ώρου ανεξάρτητααπό τον χρόνο που παρήλθε από τη λήψη τροφής. Τα κλασικά συμπτώματα της υπεργλυκαιμίας είναι η πολυουρία, η πολυδιψία και η ανεξήγητη απώλεια

σωματικού βάρους.

ή

Τιμή γλυκόζης πλάσματος ≥ 200 mg/dl, 2 ώρες μετά από τη λήψη γλυκόζης 75 gκατά τη διάρκεια της δοκιμασίας ανοχής στη γλυκόζη σύμφωνα με τις συστάσειςτης Παγκόσμιας Οργάνωσης Υγείας.

Όταν απουσιάζουν τα κλασικά συμπτώματα της υπεργλυκαιμίας, αυτά τα κριτήρια πρέπει να επιβεβαιώνονται με επανάληψη της μέτρησης της γλυκόζης σε μια διαφορετική ημέρα. Για τη διάγνωση του διαβήτη της κύησης ισχύουν διαφορετικά διαγνωστικά κριτήρια.

Προδιαβήτης

Οι φυσιολογικές τιμές της γλυκόζης πλάσματος είναι < 100 mg/dl

Άτομα που έχουν τιμές γλυκόζης νηστείας πλάσματος μεταξύ 100 και 125mg/dl έχουν διαταραγμένη γλυκόζη νηστείας (Impaired Fasting Glucose IFG).

Άτομα με τιμές γλυκόζης πλάσματος ≥ 140 mg/d l και <200 mg/dl 2 ώρες μετά από τη λήψη γλυκόζης 75 g κατά τη διάρκεια της δοκιμασίας ανοχής στη γλυκόζη και τιμές γλυκόζη νηστείας πλάσματος < 126 mg/dl, θεωρούνται ότι έχουν διαταραγμένη (παθολογική) ανοχή στη γλυκόζη (Impaired Glucose Tolerance,IGT). Τόσο τα άτομα με IFG όσο και IGT χαρακτηρίζονται ότι έχουν προδιαβήτη. 
 

http://www.ioanninamed.gr/index.php?option=com_content&view=article&id=136&catid=92&Itemid=15&lang=el#.UV_ncxn81ho.gmail


  Άσκηση 1η:

Να σχεδιάσετε την γραφική παράσταση επιπέδων της γλυκόζης ως συνάρτηση του χρόνου παροχής της (δοκιμασία γλυκόζης) για τους πιο κάτω δύο ασθενείς και να αναλύσετε τα αποτελέσματα. Τι συμβαίνει ;

    Ασθενής 1

Eξετάσεις			min	Kαμπύλη/γλυκόζης
• 40 ετών				128 mg/dl
• Βάρος: 76 κιλά			0	128
• Ύψος: 1,68 cm			30	164
• ΔΜΣ: 26,9			45	203
• Γλυκόζη νηστείας: 114			60	221
Ο Κος Αντώνης			75	223
mg/dl			90	223
• Χοληστερόλη: 153 mg/dl			120	209
• Τριγλυκερίδια: 136 mg/dl			180	199
• HDL: 42 mg/dl			240	116
• LDL: 107 mg/dl			300	82
	Ασθενής 2
Eξετάσεις			min	Kαμπύλη γλυκόζης
55 ετών			0	131
Βάρος: 83 κιλά			30	253
Ύψος: 1,70 cm			45	310
ΔΜΣ: 28,7			60	299
Γλυκόζη νηστείας: 120			90	238
mg/dl			120	138
Χοληστερόλη: 198 mg/dl			180	74
Τριγλυκερίδια: 155 mg/dl
HDL: 40 mg/dl
LDL: 138 mg/dl

Λύση:

γλυκόζη,mg/dl min  Αντώνης Θανάσης 0     128 131 30     164 253 45     203 310 60     221 299 75     223 260 90     223 238 120     209 138 180     199 74 240     116 300       82

Άσκηση 2η

Φυσιολογικό άτομο είχε συγκέντρωση γλυκόζης  αίματος <160 mg/100 ml και φυσιολογική καμπύλη μετά 2 ώρες. Τι συμπεραίνετε;

ΜΕΤΡΗΣΗ ΕΝΖΥΜΙΚΗΣ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ

Τι πρέπει να γνωρίζετε:

1. Κατανόηση της ενζυμικής ενεργότητας των ενζύμων (ΕΕ)/ορισμός.
2. Τι χρειάζεται να γνωρίζουμε για τον προσδιορισμό της ΕΕ;
3. Γιατί ο πιο πάνω προσδιορισμός γίνεται σε αρχικές συνθήκες κορεσμού όταν η συγκέντρωση υποστρώματος (S=substrate) είναι υψηλή;
4.Ορισμός του katal και της μονάδας, Unit. Πως διαφέρουν;
5. Με ποιές 2 μεθόδους προσδιορίζουμε την αρχική ταχύτητα; Πως διαφέρουν οι 2 μεθοδοι;
6. Τι είναι αντιστρεπτή και τί μη αντιστρεπτή αναστολή ενζύμων; Πως διαφέρουν; Πως τις διακρίνουμε;
7. Πόσων ειδώ αντιστρεπτές αναστολές έχουμε και πως διαφέρουν;
8. Ενώ η αναστολή της ουρεάσης με salergan αντιστρέφεται με προσθήκη κυστεϊνης, αυτή της χολινεστεράσης με αλκυλοφωσφωρικό δεν αντιστρέφεται. Αιτιολογείστε την απάντησή σας.
9. Γιατί ο προσδιορισμός της χολινεστεράσης έχει διαγνωστική αξία;

Ενζυμική Κινητική κατά Michaelis-Menten

Ο πιο πάνω σύνδεσμος περιέχει εκτεταμένες σημειώσεις για τα ένζυμα. Για λεπτομέρειες περί της ενζυμικής κινητικής κατά ΜΜ δείτε μόνο τις σελίδες 24-40. Τα υπόλοιπα είναι προαιρετικά αν και θα σας έιναι χρήσιμα γενικά μιας και δεν έχετε διδαχθεί Βιοχημεία.
Επίσης, συμβουλευτείτε τα βιβλία των Stryer ή Lehninger ή του κ. Τρακατέλλη.

Εικόνα 1: Ταχύτητα ενζυμικής αντιδράσεως
 






Εικόνα 2: Κινητική Κορεσμού





Εικόνα 3: Εξίσωση Michaelis-Menten



Εικόνα 4: Σημασία του Km



Εικόνα 5: Σημασία του Vmax



Εικόνα 6: Παράδειγμα


Άσκηση

Ποιά η φυσιολογική και φυσική σημασία των Κm και Vmax;

1. Το Km  εκφράζει κατά προσέγγιση τα ενδοκυτταρικά επίπεδα συγκέντρωσης του υποστρώµατος (Οράτε την εικόνα 6).

2. Το Km  είναι σταθερό και χαρακτηριστικό για κάθε ένζυµο και το υπόστρωµά του κάτω από δεδοµένες πειραµατικές συνθήκες pH, θερµοκρασίας, πίεσης κλπ. 

3. Το Km  µπορεί να χρησιµοποιηθεί για να συγκρίνουµε ένζυµα είτε από διαφορετικούς οργανισµούς, είτε από διαφορετικούς ιστούς του ίδιου οργανισµού.

4. Μετρώντας το Km  µιας ενζυµικής αντίδρασης, µπορούµε να ρυθµίσουµε τη συγκέντρωση του S να είναι κατά πολύ µεγαλύτερη της τιµής του Km  µε σκοπό να προσδιορίσουµε το Vmax και περαιτέρω τη συγκέντρωση του ενζύµου E, που αντιπροσωπεύει τη συγκέντρωση του συνολικού ενζύµου.
Η προσέγιση αυτή µπορεί να χρησιµοποιηθεί για τον “σχετικά ακριβή ποσοτικό προσδιορισµό” ενός ενζύµου (της ενζυμικής του ενεργότητας, ΕΕ) σε βιολογικά παρασκευάσµατα χωρίς να είναι αναγκαίος ο καθαρισµός του. Ό,τι πράξαμε στο πείραμα.

5. Μελετώντας την επίδραση διαφόρων παραγόντων στη τιµή του Km µπορούµε να αντιληφθούμε τον τρόπο δράσης και την επίδραση αυτών των παραγόντων στο ένζυµο, όπως αναστολή, ενεργοποίηση κλπ.

6. Τέλος το Km  είναι ενδεικτικό για τη σχετική καταλληλότητα ενός ή περισσοτέρων υποστρωµάτων για ένα ένζυµο. Το καλύτερο υπόστρωµα για ένα ένζυµο είναι εκείνο µε τη µεγίστη τιµή στη σχέση Vmax / Km