ΜΕΤΡΗΣΗ ΕΝΖΥΜΙΚΗΣ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ
ΑΝΤΙΣΤΡΕΠΤΗ ΚΑΙ ΜΗ ΑΝΤΙΣΤΡΕΠΤΗ ΑΝΑΣΤΟΛΗ
ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ BIOΛOΓlKHΣ ΧΗΜΕΙΑΣ
ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ, ΑΠΘ
Ορισμένες πλάγιες ομάδες αμινοξέων τής πρωτεϊνικής αλυσίδας των ενζύμων
χαρακτηρίζονται σαν "λειτουργικές" επειδή δημιουργούν ειειδικές θέσεις,χάρη στις οποίες είναι
δυνατή η ενζυμική δράση. Τέτοιες ομάδες είναι το -ΟΗ της σερίνης, ο ιμιδαζολικός δακτύλιος
της ιστιδίνης και η σουλφυδρυλική -SH ομάδα τής κυστείνης.
Ως ενεργότnτα ορίζεται τα ταύτητα κατανάλωσης του υποστρώματος ή παραγωγής τού προϊόντος η οποία οφείλεται στην κατάλυση από το συγκεκριμένο ένζυμο. Για να προσδιορίσουμε ποσοτικά την 'ενεργότητα ενός ενζύμου σ' ένα διάλυμα ή βιολογικό υγρό, χρειάζεται να ωρίζουμ.ε τη σΤQιXειοl,!εΤQίατής ενζυμικής αντίδρασης. Ακόμη πρέπει να ξέρουμε τις βέλτιστες συνθήκες ρΗ και θερμοκρασίας καθώς και το αν η αντίδραση απαιτεί την παρουσία συνενζύμου ή άλλω" ό'llωΥ. Ο προσδιορισμός γίνεται με συγκεντρώσεις υποστρώματος που ξεπερνούν το επίπεδο κορεσμού τού ενζύμου.
Κάτω από τις συνθήκες αυτές, η αρχική ταχύτητα είναι μέγιστη και ανάλογη τηςσυγκέντρωσης του ενζύμου. Η ταχύτητα παραγωγής τού προϊόντος αυξάνει ανάλογα με τη συγκέντρωση του
ενζύμου. Όταν η συγκέντρωση του υποστρώματος στην πορεία τής ενζυμικής αντίδρασης
παύει να πληρεί τις συνθήκες κορεσμού τού ενζύμου, η μέτρηση δεν αποδίδει ποσοτικά την
ενζυμική ενεργότητα. Είναι επομένως απαραίτητο να προσδιορίζεται η ταχύτητα της
ενζυμικής αντίδρασης στην έναρξή της, όταν το υπόστρωμα βρίσκεται σε αφθονία και το
ένζυμο σε κατάσταση κορεσμού. Για την ομοιόμορφη έκφραση των αποτελεσμάτων ορίστηκε ως μονάδα ενεργότητας το katal. Ένα katal είναι το ποσό τής ενζυμικής ενεργότητας που μετατρέπει ένα mol υποστρώματος σε ένα δευτερόλεπτο (mole/sec) κάτω από συνθήκες ενζυμικού κορεσμού.
Στην πράξη χρησιμοηοιούμε υποδιαιρέσεις τού katal. Η παλιότερη μονάδα μέτρησης της
ενζυμικής ενεργότητας είναι η ενζυμική μονάδα υ (enzyme unit) που ορίζεται ως το ποσό τού
ενζύμου που προκαλεί τη μετατροπή ενός μmοl υποστρώματος ανά λεπτό και στους 25°C
κάτων από ορισμένες πρότυπες συνθήκες προσδιορισμού.
Στην πράξη προσδιορίζουμε συνήθως την ταχύτητα σχηματισμού τού προιοντος
(σπανιότερα την ταχύτητα κατανάλωσης του υποστρώματος) με χημικές και κυρίως με
φασματομετρικές μεθόδους. Επειδή στην πράξη είναι δύσκολο να προσδιοριστεί με ακρίβεια
η αρχική ταχύτητα (νο) μιας ενζυμικής αντίδρασης, υπολογισμό της.
α. Συνεχής μέτρηση και καταγράφή τής απορρόφησης.Σύμφωνα με τηνμέθοδο αυτή, αμέσως μετά την ανάμιξη των αντιδραστηρ'
προσθήκη τού ενζύμου γίνονται μετρήσεις κω καταγρα έ τQς.οπο U20 ητικότητα
χρονικά διαστήματα (ανά 30 s ή ανά 1 min πί ένα ορισρένο χρονικό διάστημα (
έως 1Οίηίπ). Στη συνέχεια σχεδιάζεται σε χιλιοστομετρικ6 χαρτί το διάγραμμα, τοπ
τις τιμές τής απορροφητικότητας Α στον άξονα των Υ και τις αντίστοιχες τιμές τ
στον άξονα των χ.
Φέρουμε την εφαπτομένη στην καμπύλη στη χρονική στιγμή t - Ο. Η
καμπύλης είναι dAldt και ισούται με την αρχική ταχύτητα της ενζυμικής αντίδ
συνέχεια χρησιμοποιούμε πρότυπη καμπύλη για να εκτιμήσουμε ποια είναι η μετ
συγκέντρωσης του υποστρώματος ή του προϊόντος που επέφερε την
απορροφητικότητας. Αντί για καμπύλη μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε το
μοριακής απορροφητικότητας του μετρούμενου υλικού.
Σε συντομία το σχήμα της παραπάνω εργασίας είναι:
1. Μέτρηση ανά 30 s επί ορισμένο χρόνο, συνήθως 5 έως 1Οmin.
2. Σχεδίαση καμπύλης με συντεταγμένες στον άξονα των χ τον χρόνο
άξονα των Υ την απορροφητικότητα Α.
3. Χάραξη της εφαπτομένης στην αρχή τού χρόνου.
4. Εύρεση της dAlmin.
5. Από την dAlmin και με χρήση πρότυπης καμπύλης ή μοριακού
απορροφητικότητας εύρεση της κατανάλωσης του υποστρώματος
παραγωγής τού προϊόντος ανά min.
7. Από τη στοιχειομετρία τής ενζυμικής αντίδρασης εύρεση των katals.
β. Μετρήσεις σε ορισμένο χρόνο.Σύμφωνα με τη μέθοδο αυτή η πρώτη μέτρηση και καταγραφή τής απορροφη
(Α1) γίνεται αμέσως μετά την ανάμιξη των αντιδραστηρίων και την προσθήκη τού
Μετά από ένα ορισμένο χρονικό διάστημα t γίνεται η δεύτερη μέτρηση και καταγ
απορροφητικότητας (Α2). Η διαφορά των τιμών ΔΑ = Α1 - Α2 οφείλεται στη μετα
συγκέντρωσης που επήλθε στο χρονικό διάστημα t. Συνήθως με την μέθοδο αυτή
την ενζυμκή ενεργότητα συγκρίνοντας την ΔAJt με αυτήν που μετράται με ταυτόση
σε διάλυμα γνωστής ενεργότητας Υπάρχει όμως η δυνατότητα να χρησιμοπ
πρότυπη καμπύλη από την οποία μπορούμε να εκτιμήσουμε την μεταβ
συγκέντρωσης στην μονάδα τού χρόνου.
Προσδιορισμός ενζυμικής ενεργότητας σε πλάσμα ή ορόΌταν μετρούμε την ενεργότητα ενός ενζύμου στο πλάσμα είναι απαραίτητο η
αιμοληψία να γίνεται με αντιπηκτικό (π.χ. οξαλικά άλατα, ηπαρίνη, ΕΟΤΑ, κιτρικό νάτριο) και
στη συνέχεια να απομακρύνονται τα έμμορφα συστατικά τού αίματος με φυγοκέντρηση.
Αντίθετα, αν πρόκειται να προσδιοριστεί η ενεργότητα του ενζύμου σε ορό, η αιμοληψία
γίνεται χωρίς αντιπηκτικό και αναμένουμε την πήξη τού αίματος μετά την οποία παρατηρούμε
σαφή διαχωρισμό τού πήγματος από τον ορό, τον οποίο παραλαμβάνουμε για περαπέρω
χρήση.
ΑΝΤΙΣΤΡΕΠΤΗ ΚΑΙ ΜΗ ΑΝΤΙΣΤΡΕΠΤΗ ΑΝΑΣΤΟΛΗ ΕΝΖΥΜΙΚΗΣ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣΗ τροποποίηση, με φυσικό ή χημικό τρόπο. των λειτουργικών ομάδων είτε της ενεργής
περιοχής τού ενζύμου, είτε άλλων περιοχών που έχουν σχέση με την ενζυμική δράση έχει
σαν αποτέλεσμα την μεταβολή τής λειτουργικής του ικανότητας. Μια ουσία η οποία ελαπώνει
την ταχύτητα μιας ενζυμικής αντίδρασης είναι ένας αναστολέα ς τής αντίδρασης αυτής. Η
ενζυμική αναστολή μορεί να είναι αντιστρεπτή ή μη αντιστρεπτή. Η φύση τή αναστολής
εξαρτάται από τον τρόπο σύ"δεσης του αναστολέα με το ένζυμο. Μια σταθερή ομοlOπολική
σύνδεση προκαλεί μια μόνιμη αναστολή τής ενζυμικής δράσης, οπότε έχουμε μη
αντιστρεπτή αναστολή. Αντίθετα, μια χαλαρή σύνδεση του ~ναστoλέα με το ένζυμο οδηγεί
σε αντιστρεπτή αναστολή. Στην τελευταία περίπτωσηΌνήκουν τρεις τύποι αναστολής:
1.
Συναγωνιστική αναστολή. Ο αναστολέας :παρουσιάζει ο οιότ τες δol!ός με το
υπόσΤQ..ωμα.καιτο συναγωνίζεται για σύνδεση στην ενεργή περιοχή τού ενζύμου.
2.
Μη συναγωνιστική αναστολή. Ο αναστολέας δεν παρουσιάζει ομοιότητες
δομής με το υπόστρωμα και ενώνεται με το ένζυμο σε θέση διαφορετική από την
ενεργή περιοχή.
3.
Ασυναγώνιστη αναστολή. Σπάνια περίπτωση κατά την οποία ο αναστολέας
ενώνεται με το μεταβατικό σύμπλοκο ενζύμου-υποστρώματος (ES).
Εάν Π.χ. σε ένα ένζυμο που διαθέτει λειτουργική -SH επιδράσουν ανόργανα άλατα
βαρέων μετάλλων ή οργανικές ενώσεις υδραργύρου, παρατηρείται αναστολή τής ενζυμικής
ενεργότητάς του. Η αναστολή αυτού τού τύπου είναι αντιστρεπτή αφού η απομάκρυνση του
μετάλλου-αναστολέα έχει σαν αποτέλεσμα το ένζυμο να επανακτά την ενεργότητά του. Έτσι
η προσθήκη στο μίγμα τής ενζυμικής αντίδρασης ενώσεως που διαθέτει -SH όπως το
αμινοξύ κυστεΤνη αποσπά τον αναστολέα από το μόριο του ενζύμου και αποκαθιστά την
ενεργότητά του.
.
Αντίθετα, κλασικό παράδειγμα μη αντιστρεπτής αναστολής είναι η επίδραση
οργανοφωσφορικών ενώσεων σε ένζυι,Jαπου σΤΩνενεργό περιοχή τους διαθέτουν ενεργή
σερίνη. Στην τελευταία περίπτωση είναι αδύνατη η απομάκρυνση του αναστολέα και η
αναστολή είναι μόνιμη.
ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ
ΠΕIΡΑΜΑ\{ΑντιστρεΠΤή αναστολή - Εκτίμησή της ενεργότητας της οuρεάσης
Η ουρεάση είναι τ,? ένζυμο που υδρολύει την ουρία σύμφωνα με την αντίδραση:
Απαντά στα φυτά και στα βακτήρια αλλά απουσιάζει εντελώς από τους ιστούς των
ζώων. Το ανθρακικό αμμώνιο που παράγεται αλκαλοποιεί το περιβάλλον τής αντίδρασης και
η αύ σ του Η που συνοδεύει την ενζυμική δράση είναι και μέτρο τής ενεργότητας του
ενζύμου .
•..
Το ένζυμο διαθέτει σουλφυδρυλική (-SH) ομάδα και υφίσταται αντιστρεπτή αναστολή
από το οργανικό παράγωγο Salyrgan σχηματίζοντας μερκαπτίδιο κατά την αντίδραση:
Η επίδραση του αναστολέα εξουδετερώνεται αν στο μίγμα τής ενζυμικής
αντίδρασης προστεθεί το αμινοξύ Kυστε'fνη που διαθέτει -SH ομάδα στο μόριό του.
Υλικά
Μέθοδος
Σε τρεις δοκιμαστικούς σωλήνες προσθέστε τα παρακάτω αντιδραστήρια:
Προσθέστε από δύο σταγόνες φαινολοφθαλεΐνης και επωάστε στους 25 βαθμούς Κελσίου.
Παρατηρείστε και εξηγείστε το χρώμα που σχηματίζεται.
• ΠΡΟΣΟΧΗ! Ισχυρό δηλητήριο
ΠΕΙΡΑΜΑ 2. Μη αντιστρεπτή αναστολή-Μέτρηση ενεργότητας ψευδοχολινεστεράσης.
Τα ένζυμα με 9ράση χολινεστεράσης, καταλύουν .την υδρόλυση των εστέρων τής
χολίνης σε χολίνη και-ελεύθερο-λιηαρό οξύ.
εστέρας χολίνης λιπαρό οξύ χολίνη Δύο ένζυμα μπορούν να ενταχθούν στην κατηγορία αυτή, η ακετυλοχολινεστεράση(E.C.3.1.1.7) και η ψευδοχολινεστεράση ~(E.C.31.1.8). Η ενζυμική δράση τής
ακετυλο άσ πε ιορίζεται αποκλειστικά στ διάσπαση της ακετυλοχο ινης. Το ένζυμο
αυτό παρουσιάζει την μεγαλύτερη ενζυμική δράση σε ρΗ 7.2 και η δράση το
αναστέλλεται από την περίσσεια του υποστρώματός του. Η βιολογική του αποστολή έχει
αποσαφηνισθεί και συνίσταται στην διάσπαση της ακετυλοχολίνης στις συνάψεις. Για τον
λόγο αυτό απαντά κυρίως στα κύτταρα εκείνα που συμμετέχουν στην χολινεργική μετάδοση
του νευρικού ερεθίσματος, ανευρίσκεται όμως και σε άλλα νευρικά κύτταρα όπως και στο
ερυθροκύτταρο. Η ψευδοχολινεστεράση παρουσιάζει πλατιά ειδίκευση καταλύοντας την υδρόλυση
όλων των εστέρων τής χολίνης. Εκτός από τους εστέρες τής χολίνης η ψευδοχολινεστεράση
υδρολύει και τους εστέρες τής θειοχολίνης, ιδιότητα που χρησιμοποιούμε στον προσδιορισμό
τής ενεργότητάς της. Είναι ενεργή σε ευρεία περιοχή τού ρΗ και δεν αναστέλλεται όταν η
συγκέντρωση του υποστρώματός της είναι μεγάλη. Η διαμόρφωση των χολινεστερασών δημιουργεί δύο διακριτές λειτουργικές περιοχές. Στην πρώτη περιοχή που χαρακτηρίζεται σαν ανιονηκή υπάρχει μια αρνητικά ιοντισμένη καρβοξυλική ομάδα στην οποία συνδέεται το θετικά φορτισμένο άτομο Ν+ τού χολινεστέρα και είναι η περιοχή σύνδεσης του υποστρώματος. Στη δεύτερη περιοχή που είναι η καταλυτική και χαρακτηρίζεται σαν εστερική σχηματίζεται ένας εστερικός δεσμός μεταξύ μιας σερίνης και μιας ιστιδίνης με την συνεισφορά ενός -ΟΗ από την πρώτη και μιας ιμιδαζολικής ομάδας από την δεύτερη (σχήμα 1).
Η διάσπαση του υποστρώματος από τις χολινεστεράσες ακολουθεί μηχανισμό όμοιο
με αυτό των πρωτεασών. Οι αναστολείς των χολινεστερασών παρουσιάζουν μεγάλο
φαρμακολογικό ενδιαφέρον. Η φυσοσΤΙΥμίν!"} (εσερίνη) και η νεοστιγμίν!"} σχηματίζουν
σύμπλοκο με τις χολινεστεράσες που υδρολύεται πολύ αργά (με καρβαμυλίωση του -ΟΗ της
σερίνης που βρίσκεται στην εστερική περιοχ' των ολινεστε σών~. Ισχυρότεροι αναστολείς
είναι οι οργανοφωσφορικοι εστέρες που σχηματίζουν μόνιμα σύμπλοκα με το -ΟΗ της.
σερίνης. Οι αναστολείς αυτοί χρησιμοποιούνται στη γεωργία για την καταπολέμηση
ανεπιθύμητων οργανισμών καθώς και στο χημικό πόλεμο (σχήμα 2).
Σχήμα 2
Ο προσδιορισμός τής ενεργότητας της ψευδοχολινεστεράσης παρουσιάζει διαγνωστική
~ Η τιμή τής ενεργότητας του ενζύμου εμφανίζεται αυξημένη σε παθήσεις τού
---
ήπατος, στις κακοήθεις νεοηλασίετ; στη φυματίωση και το άσθ α. Αντίθετα, η τιμή αυτή
ελαττώνεται σε περιπτώσεις δηλητηριάσεων με οργανοφωσφορικούς εστέρες. Ακόμη, επειδή
είναι δυνατή η ύπαρ κάΠOJας_γενετικr')ςανεπάρκειας του εν~ύb!ού είναι απαgαίτ τ
μέτρησή του όταν πρόκειται να δοθεί γενική αναισθ σία προκειμένου να γίνει χειρουργική
επέμβαση.
Η φυσιολογική τιμή τής ενεργότητας της χολινεστεράσης στον ορό είναι 2.5 ± 0.6 U/ml.
Αρχή τής μεθόδου
Η ψευδοχολινεστεράση καταλύει την υδρόλυση της ακετυλοθειοχολίνης σε θειοχολίνη
και οξικά οξύ.
Η ενζυμική αντίδραση συζεύγνυται με χρωστική αντίδραση και συγκεκριμένα η
σουλφυδρυλική ομάδα (-SH) τής θειοχολίνης αντιδρά με το αντιδραστήριο Ellmann που
λειτουργεί σαν χρωμογόνο (ΟΝΤΒ: Dithio-BisNitroBenzoic acid = διθειο-δινιτροβενζοϊκά οξύ).
Υλικά
Οράς αίματος ανθρώπου
Ιωδιούχος ακετυλοθειοχολίνη, 0.156 Μ
Αλκυλοφωσφορικό: 0.0055% διμεθυλο-διχλωρο-βινυλοφωσφορικό
ΟΝΤΒ, 0.25 mM.
Μέθοδος
2. Μηδενίστε το φωτόμετρο στα 412 nm χρησιμοποιώντας το δείγμα 1 ως τυφλό.
3. Φωτομετρήστε το δείγμα 2 αμέσως μετά την προσθήκη τού ορού και
συνέχεια κάθε 30 sec και επί 3 min.
4. Φωτομετρήστε το δείγμα 3 αμέσως μετά την προσθήκη τού ορού
συνέχεια κάθε 30 sec και επί 3 min.
5. Υπολογίστε την ενεργότητα της χολινεστεράσης σε kataI/mI ορού σε κάθε δείγμ
γνωρίζοντας ότι ο μοριακός συντελεστής απορροφητικότητας του συμπλόκο
θειονιτροβενζοϊκού-θειοχολίνης είναι 1.36 χ 104 M-1cm-1.
6. Υπολογίστε το βαθμό τής αναστολής σε % στο σωλήνα 3.
Υπολογισμός ενζυμικής ενεργότητας
Για τον υπολογισμό τής ενζυμικής ενεργότητας εφαρμόζουμε τον ακόλουθο τύπο:
όπου:
Α ο μοριακός συντελεστής απορροφητικότητας [1.36χ10^4] για να μετατρέψουμε
μεταβολή τής οπτικής πυκνότητας σε μεταβολή συγκέντρωσης
Β ο όγκος σε λίτρα τής ενζυμικής αντίδρασης [0.0031] για να βρούμε πόσα moIes
προϊόντος παράχθηκαν στα 3.1 mI τής αντίδρασης
. Γ ο όγκος σε mI τού ορού που χρησιμοποιήθηκε [1/0.05] για να εκφράσουμε την
ενεργότητα της χολινεστεράσης σε katal/mI ορού.
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑΑντιστρεπτή αναστολή: Εκτίμηση της ενεργότητας της οuρεάσης.
ικαιολογήστε το χρώμα που εμφανίζε_ταιμετά την προσθήκη τής φαινολοφθαλείνης σε κάθε
σωλήνα.
1. Σωλήνας 1 (Δράση ουρεάσης επί τής ουρίας):
2. Σωλήνας 2 (Δράση ουρεάσης επί τής ουρίας παρουσία ενώσεως του Hg):
3. Σωλήνας 3 (Δράση ουρεάσης επί τής ουρίας παρουσία ενώσεως του Hg και του
αμινοξέος κυστείνη):
Μη αντιστρεπτή αναστολή: Μέτρηση της ενεργότητας της ψευδοχολινεστεράσης.
1. Υπολογίστε την ενεργότητα της χολινεστεράσης σε Units/ml ορού σε κάθε σωλήνα
2. Υπολογίστε το βαθμό τής αναστολής σε %. 
